具体来说,TCSPC技术的核心原理是通过探测器检测光子到达时间来实现。通常以激光脉冲的发射时间作为参考信号,这直接反映了样品的激发时间。样品会以极高的重复频率接受激光脉冲激发,这种高频激发的优势在于:通过单光子测量,能在最短时间内获得具有统计学意义的样品去激发行为过程。此外,由于测量频率极高,光源强度波动及由此产生的测量误差也能被有效抵消。为精确测量光子发射时间,系统一方面采用TDC系统,另一方面则使用Gps/s量级的高速模数转换器。

利用TCSPC进行衰变数据分析。
在时间相关单光子计数技术中,通过记录样品周期性激发后释放的单个光子,可精确测定该样品去激发行为的时序演变规律。
为获得具有统计学意义的结果,通常需要在特定时间段内进行多次单光子测量,这种方法能有效捕捉光强变化的瞬时波动。TCSPC(光子计时技术)旨在研究通常发生在皮秒量级的光子发射过程。
该技术的主要应用领域是荧光寿命测量(光致发光衰减测量)。目前,TCSPC技术在灵敏度、动态范围和精度方面已超越大多数其他技术。
我们采用超高时间分辨率测量激发与光子发射之间的时间延迟(此处称为发射时间)。通过使用短脉冲激光激发样品,其强度经过精确调控,确保绝大多数脉冲不会引发样品激发——根据经验法则,超过95%的脉冲不会产生相互作用。因此,典型的脉冲重复频率远高于光子交换速率。这种方案确保每次激发仅产生一个(或更少)荧光光子,并能识别并剔除前次激发脉冲产生的光子。为获得统计学意义上的显著结果,每个测量过程会重复数百万次。
将单个测量结果整理成直方图,展示各发射时间出现的频率。TCSPC概念还可应用于成像技术,例如FLIM。
TCSPC测量的优势包括:
· 样品激发所需的光脉冲强度较低,从而最大限度地减少样品损伤并避免非线性效应。
· TCSPC具有较高的时间分辨率。
· TCSPC提供广泛的动态范围。
· 激发光源强度的波动对TCSPC测量结果的影响微乎其微。
· 由于TCSPC是在探测器的所谓“计数模式”下进行的,因此对探测器的要求比模拟测量要低。
· 与同样具备高时间分辨率和快速获取全光谱的条纹相机不同,TCSPC系统成本显著更低,仅需飞秒激光激发即可满足特定研究需求。
· TCSPC可与扫描技术结合,用于荧光寿命成像(FLIM)。
为实现高时间分辨率的测量,需要采用恒定比例鉴别器:大多数探测器输出的模拟信号(通常是短脉冲)需转换为光子到达时间的数字信息。探测器信号通常具有脉冲高度分布较宽的特性。恒定比例鉴别器会在达到固定比例的脉冲高度时生成数字计时信号。因此,由光源不稳定或光电倍增管固有脉冲高度分布引起的脉冲高度波动,在此过程中基本可以忽略不计。
TCSPC技术主要应用于单分子检测、光谱分析及荧光相关光谱研究。该技术不仅用于研究荧光寿命(即FLIM),还通过时间相关单光子计数技术,助力光纤领域的脉冲光或调制光时序分析(相关应用包括光时域反射测量、量子研究及量子密钥分发等)。
TCSPC技术主要应用于单分子检测、光谱分析及荧光相关光谱(FCS)领域。除了用于研究荧光寿命外,该技术还通过时间相关单光子计数技术,为光纤研究提供支持,以探究脉冲或调制光在时域中的特性。

TCSPC衰变测量方案
激光源(有时称为飞秒激光器)是激发光源。在选择激光源时,样品的激发能量及其预期的荧光寿命起着决定性作用。
当激光器重复频率较高(通常在1-100 MHz范围内)时,泵浦脉冲从激光器发出的同时,激光器会向计算机发送一个启动信号,该启动脉冲触发时间测量。
激光脉冲通常持续时间短于0.1纳秒,通过中性密度滤光片投射到样品表面。该滤光片能有效抑制杂散光干扰探测器信号,并相应减弱激发脉冲强度。当样品分子在脉冲周期内发射光子并击中探测器时,即触发时间测量的停止信号。探测器前方设有截止滤光片,用于将测量范围限定在目标光谱区间。在某些测量系统中,样品分子发出的光还会经过单色仪处理,以便获取发射波长的相关信息。
通过快速、高精度的数据采集技术实现测量信号的同步与数字化,最终生成记录时间数据的直方图——这正是cronologic的核心竞争力,cronologic的TDC产品主要是xTDC4,xHTDC8-PCIe,xTDC4-TBD。
· PMT(光电倍增管)——经典方案,成本低廉、增益高,但不适用于快速检测。
· MCP:微通道板之所以广受欢迎,是因为其灵敏度高于光电倍增管(PMT),且响应速度更快。
· APD/SPADs(雪崩光电二极管):作为光电倍增管(PMT)的半导体等效器件,其脉冲宽度极短(FWHM 30-400ps),因此能够检测到极快的光致发光衰减。
· 混合光电倍增管(PMT)将传统光电倍增管与雪崩二极管相结合,不仅实现了低传播时间展宽,还显著提升了计数效率。这类探测器几乎不会产生后脉冲,其增益主要通过单步实现。因此,它们能生成脉冲高度分布狭窄的单光子脉冲,使得光子累积效应的区分变得更为容易。由于小幅度波动特性,这种设计有效消除了CFD电路对时间抖动的残留影响。
在TCSPC测量过程中,需特别注意由所谓“脉冲堆积”效应可能引发的测量误差:
当两个或多个光子在极短时间内相继发射时,例如由于数据采集系统的死区时间,个别光子可能无法被记录。这种测量误差会导致记录的光子分布直方图系统性改变,因为大部分“延迟到达”的光子会被丢失。要避免光子“堆积”问题,可以通过降低激发强度(从而减少样品发射的光子比例)来实现。因此,TCSPC装置的设计通常遵循这样的原则:在50个激发脉冲中,仅有少量(通常仅一个)会产生荧光响应。
个体计数通过TDC生成的时间戳记录在时间区间内,并按此显示。
为准确记录荧光光子到达时间与样品激发时间的相对关系,实验采用最高分辨率的电子设备。最初,TCSPC数据通过时间到幅度转换器(TAC)和瞬态记录仪(模数转换器,ADC)进行采集:
含有发射时间信息的信号经恒定分数鉴别器(CFD)处理后,参考脉冲随即激活时间触发器(TAC)。TAC会在电容器上生成内部电压斜坡,当检测到样品发出的荧光光子时,电压上升过程立即停止。随后模数转换器(ADC)对TAC电压进行评估,并将其转换为数字时间戳——电压值越高,对应的发射时间越晚。在反向TAC模式下,激发脉冲与检测光子的角色互换:此时激发脉冲会停止TAC的电压上升。记录的时间戳可进一步通过多通道分析仪(MCA)进行直方图处理。这种经典测量方法存在相对较长的死区时间。
新一代TCSPC系统采用了现代时间数字转换器(TDC,即时间间隔分析仪)的高效数据采集技术。这类设备能将计时信号的到达时间直接转换为数字时间戳。得益于现代TDC的超短死区时间特性,有时甚至能在单个激发周期内记录多个光子。必要时,每个光子探测事件还可附加记录其他信息,例如光的波长、偏振状态、在图像区域中的位置、样品特性参数、激发波长等。这些技术优势为测量数据的可视化呈现和分析提供了多样化的处理方案。
TCSPC测量的分辨率受多种因素制约,这些因素的总和被称为仪器响应函数(IRF):
· 激光脉冲的有限宽度(最大因子)
· 电子信号的有限上升/下降
· 探测器的时间分辨率
· 电子设备抖动
通常可通过测量‘瞬时响应’来原位获取IRF时间总和。